細胞遷移在許多復雜的生理和病理過程中起著重要作用。傷口愈合測定是一種研究體外細胞遷移的簡單方法。該測定基于以下觀察：即在融合的細胞單層上產生人工間隙時，所產生的間隙邊緣上的細胞將開始遷移，直到建立新的細胞-細胞接觸。
ibidi Culture-Insert插件系列產品為傷口愈合實驗提供了完整的解決方案，從樣品制備到圖像分析只需要幾個步驟。
本應用是使用ibidi Culture-Insert 2 Well分析MCF-7細胞遷移的詳細方案。
圖 1. 使用ibidi Culture-Insert 2 Well行傷口愈合測定的實驗工作流程
ibidi Culture-Insert 2 Well 放置在細胞培養(yǎng)表面上，提供兩個細胞培養(yǎng)庫，每個庫由一條500μm壁隔開。在兩個儲液庫中填充細胞懸浮液僅允許細胞在指定區(qū)域生長。移除培養(yǎng)插件在適當?shù)募毎街?，產生大約500 μm的無細胞間隙。
在顯微鏡評估傷口愈合過程。根據您感興趣的焦點，可以通過使用視頻顯微鏡或通過在不同時間點觀察圖像來完成。測量細胞覆蓋區(qū)域的變化允許量化傷口閉合的速度并提供細胞遷移特征。
實驗工作流程也可以應用于Culture-Insert 3 Well和Culture-Insert 4 Well。唯一的區(qū)別是更多的孔和相應的更多的無細胞間隙。
所需材料
·細胞：MCF-7（ATCC:HTB-22；DSMZ:ACC115）
·Ibidi的實驗耗材：2孔插件放在35毫米的培養(yǎng)皿中，高壁（ibidi，81176）
·細胞培養(yǎng)表面：ibitreat
·細胞培養(yǎng)基：RPMI (Sigma, R8758) + 10% FCS (Sigma, F0804)
·細胞解離溶液：Trypsin-ETDA (Sigma, 59418C)
·無菌鑷子
·倒置顯微鏡，最好具有自動圖像采集系統(tǒng)和用于活細胞成像的stage top incubator培養(yǎng)箱
實驗工作流程
步驟1:細胞接種
為了建立可靠的數(shù)據采集系統(tǒng)，必須在實驗開始前確定實驗參數(shù)。例如：選擇正確的細胞接種密度。我們建議使用24小時后產生100%光學融合細胞層的密度。
1.像往常一樣準備細胞懸液。建議包括離心步驟，以去除死細胞和細胞碎片。將細胞懸浮液調節(jié)至約3x105個細胞/ml的細胞濃度，以在24小時后獲得融合的細胞層。
2. 將70µl細胞懸液滴入培養(yǎng)皿2孔插件的每個孔中。避免搖晃µ-Dish培養(yǎng)皿，因為這將導致細胞分布不均勻。
3. 將細胞在37°C和5% CO2下培養(yǎng)至少24小時。
圖2. 在ibidi Culture-Insert 2 Well中接種細胞
步驟2:劃痕形成
融合細胞層是開始該測定的先決條件。移除Culture-Insert 2孔插件后加入新鮮培養(yǎng)基。如有必要，在培養(yǎng)基中補充抑制或增強物質，以評估其對細胞遷移行為的影響。
1. 24小時后在顯微鏡下檢查細胞密度。如果24小時后仍未形成細胞融合層，則將µ-Dish培養(yǎng)皿再次放入細胞培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)12-24小時。定期檢查匯合處。
2. 用無菌鑷子輕輕取出Culture-Insert 2孔插件。如圖3所示，用鑷子輕輕夾住插件的一角取出插件。
圖3.使用無菌鑷子移除ibidi Culture-Insert 2孔插件
3.移除插件后，檢查細胞層是否仍附著在μ-Dish培養(yǎng)皿的表面。
4.用無細胞培養(yǎng)基或PBS清洗細胞層，去除細胞碎片和未附著的細胞。
5.推薦使用體積為2mL的無細胞培養(yǎng)基填充μ-Dish培養(yǎng)皿。
圖4. 由 ibidi Culture-Insert 2 Well 創(chuàng)建的無細胞間隙
步驟3：獲取顯微鏡圖片：
我們建議錄制延時視頻，以確定時間依賴性和細胞遷移的特征。
1. 將培養(yǎng)皿放在顯微鏡上并移動，直到圖像中捕捉到間隙和兩個細胞的正面。使用4x/5x或10x物鏡。傷口區(qū)域的方向并不重要，但需要水平或垂直。
2. 在接下來的幾個小時內，通過多次拍攝圖像開始觀察過程。
3. 以30分鐘的時間間隔對在ibiTreat表面上培養(yǎng)的MCF-7細胞進行20小時的時間推移測量。
圖5.使用MCF-7細胞的遷移測定的時間流逝測量（比例尺：200 μm）
步驟4：使用FastTrack AI和數(shù)據解釋進行定量圖像分析
必須分析顯微照片以獲得關于培養(yǎng)細胞的遷移特征的信息。這可以通過使用圖像處理軟件手動完成，也可以通過使用ibidi提供的傷口愈合快速通道人工智能圖像分析進行自動圖像分析。
這里顯示的示例數(shù)據是使用FastTrack AI進行分析的。自動圖像分析檢測細胞覆蓋面積。繪制細胞覆蓋面積隨時間的變化圖，顯示間隙閉合的過程。線性相位可以用來表征遷移(=傷口閉合的速度)。
線性相的斜率顯示，劃痕閉合的平均速度為0.0184*106µm²/小時（=0.44*106µm²/天）。
圖6. FastTrack AI對傷口愈合實驗的定量圖像分析
滬公網安備31011202005471 
