在侵襲實驗中，長時間追蹤熒光標(biāo)記的細胞對于研究細胞群體的遷移行為非常有益。當(dāng)使用不表達報告染料的天然細胞系時，必須對細胞進行瞬時標(biāo)記。然而，許多瞬時染料會影響細胞行為，并且只適用于短期顯微鏡成像，因為它們的強度會因降解、光漂白或細胞分裂而降低。超亮熒光納米顆粒提供了一種很有前景的新方法。經(jīng)過幾個小時的短暫孵育期后，細胞會被生物相容且無毒的熒光納米顆粒包裹，并可以連續(xù)成像以進行縱向研究。
在本應(yīng)用說明中，兩種不同的細胞系用Cellaris™熒光納米顆粒(Luminicell)標(biāo)記，然后接種在2孔插件共聚焦皿中(ibidi，81176)進行2D侵襲實驗。移除2孔插件(Culture-Insert 2 Well)后，熒光標(biāo)記有助于區(qū)分兩種細胞群體的遷移行為。
在ibidi 2孔插件共聚焦皿中生長的MCF-7細胞(Cellaris™ 670.紅色)和NIH-3T3細胞(Cellaris™ 540.綠色)的共培養(yǎng)
ibidi雙細胞共培養(yǎng)侵襲實驗新方案
1 材料
1.1 試劑和緩沖液
Cellaris™ 540 - 細胞標(biāo)記試劑盒(綠色)和Cellaris™ 670 - 細胞標(biāo)記試劑盒(紅色)，(Luminicell)
MCF-7細胞系(乳腺癌，人)和NIH-3T3細胞系(成纖維細胞，小鼠)
細胞培養(yǎng)基：RPMI-1640(Gibco,21845034)，補充10%胎牛血清(Gibco;10270106)
標(biāo)準(zhǔn)細胞培養(yǎng)試劑(PBS、胰蛋白酶/EDTA)
1.2 設(shè)備
• 預(yù)置2孔插件的共聚焦皿(Culture-Insert 2 Well in µ-Dish 35 mm)(ibidi，81176)
• 標(biāo)準(zhǔn)細胞培養(yǎng)設(shè)備(無菌工作臺、細胞培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、移液器、搶頭等)
• 鑷子
• 配備FITC和Cy5 HC濾光片組(Nikon)的Nikon TI顯微鏡、4x CFI PlanFluor DL物鏡(Nikon)、LED Sola Light Engine (lumencor)、ORCA-Flash 4.0-LT相機(Hamamatsu Photonics)
• ibidi載物臺培養(yǎng)箱載玻片/培養(yǎng)皿，CO2/O2–銀色系列(Stage Top Incubator Slide/Dish, CO2/O2–Silver Line(ibidi，12722))
2 準(zhǔn)備
2.1 使用Cellaris™細胞標(biāo)記試劑盒標(biāo)記細胞
• 在T25細胞培養(yǎng)瓶(或其他細胞培養(yǎng)實驗室器皿)中培養(yǎng)細胞至80-90%匯合。
• 通過將Cellaris™納米顆粒在5ml補充細胞培養(yǎng)基中稀釋至2nM(100倍)，分別制備染色溶液。
• 用制備好的染色溶液替換細胞培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，并在細胞培養(yǎng)箱中孵育1-24小時，具體時間根據(jù)細胞類型而定。此處，我們將MCF-7細胞用Cellaris™ 670染色，將NIH-3T3細胞用Cellaris™ 540 染色，持續(xù)2-4小時。
2.2 在Culture-Insert 2 Well中設(shè)置傷口愈合實驗
• 染色后，按常規(guī)方法收集細胞。包括離心步驟以去除細胞碎片和游離納米顆粒。
• 根據(jù)細胞類型，準(zhǔn)備3-7×105個細胞/ml的細胞懸液。對于MCF-7和NIH-3T3.使用3×105個細胞/ml的細胞濃度，可在24小時內(nèi)形成匯合的細胞層。
• 在無菌工作臺中取出帶有Culture-Insert 2 Well的µ-Dish。
• 在一個孔中加入70µl MCF-7懸液，在Culture-Insert的第二個孔中加入70µl NIH-3T3懸液。讓細胞沉降5-10分鐘，避免搖晃，因為這會導(dǎo)致細胞分布不均勻。
• 將帶有Culture Insert的µ-Dish放入濕潤的腔室(例如，帶有濕紙巾的培養(yǎng)皿)中，然后放入細胞培養(yǎng)箱中。在37°C和5%CO2下孵育24小時或直到細胞層匯合。
• 將µ-Dish放入無菌工作臺上，用無菌鑷子夾住Culture-Insert 2 Well的一角，輕輕移除Culture-Insert 2 Well。
• 向µ-Dish中加入2 ml補充的細胞培養(yǎng)基。如有必要，可進行洗滌步驟以去除未貼壁細胞或細胞碎片。
• 用蓋子蓋住µ-Dish。此時，樣品已準(zhǔn)備就緒，可進行鏡檢成像。
圖1.Culture-Insert 2 Well實驗流程
2.3 活細胞熒光顯微成像
• 提前預(yù)熱顯微鏡的孵育系統(tǒng)(如ibidi Stage Top Incubator)(在實驗前至少0.5-2小時)。在37°C、5%CO2和80%濕度下進行實驗。
• 將樣品放置在顯微鏡載物臺上的孵育腔內(nèi)，并使用4倍物鏡聚焦細胞層。
• 實驗設(shè)置：每20分鐘采集一次傷口區(qū)域的相差、FITC(Cellaris™ 540)和Cy5(Cellaris™ 670)通道圖像。確保在圖像采集間隔期間關(guān)閉照明光源。
1)Cellaris™ 540可用紫/藍光源激發(fā)(Ex 423nm，Em 540nm)。
2)Cellaris™ 670可用藍/綠光源激發(fā)(Ex 506nm，Em 670nm)。
重要提示：為減少光照對細胞造成的應(yīng)激，建議降低激發(fā)光源的照明強度，例如在中性密度濾光片(ND4. ND8)插入光路中。
• 監(jiān)測細胞行為24-72小時。使用合適的圖像分析軟件(例如ImageJ(NIH))處理和評估延時圖像。
3 結(jié)果
染色過程有效地將納米顆粒整合到細胞中，而對細胞活力沒有明顯的adverse effects(不良影響).Cellaris™為延時顯微鏡提供了清晰且可區(qū)分的熒光信號。Culture-Insert 2 Well能夠創(chuàng)建一個清晰的劃痕間隙，從而可以精確追蹤兩種單獨標(biāo)記的細胞群體的細胞遷移和行為隨時間的變化，如圖2所示。在活細胞成像條件下實時觀察細胞運動，可為劃痕愈合的動態(tài)提供有價值的見解，這在圖2中清晰可見。
圖2.MCF-7細胞(Cellaris™ 670.紅色)和NIH-3T3細胞(Cellaris™ 540.綠色)的延時圖像顯示了各自細胞系的遷移以及初始500µm寬的劃痕間隙的閉合。黃線標(biāo)記間隙的中線。MCF-7細胞遷移得更快，并在36小時內(nèi)閉合了間隙。比例尺= 100µm
相差和熒光成像的結(jié)合能夠可視化標(biāo)記的均勻性。圖3顯示，顆粒不僅在一個細胞內(nèi)是均勻的，而且在整個細胞層上也是均勻的。此外，正如白色箭頭所指示的那樣，當(dāng)兩個細胞前沿融合時，似乎沒有兩個細胞之間的交叉標(biāo)記。這一證據(jù)表明，即使在長期活細胞研究中，Cellaris™在多色實驗中也不會表現(xiàn)出串?dāng)_效應(yīng)。
圖3.在實驗開始90小時后拍攝的MCF-7(Cellaris™ 670.紅色)和NIH-3T3(Cellaris™ 540.綠色)融合圖像的細節(jié)圖。左側(cè)圖像中箭頭顯示細胞侵入另一個群體。右側(cè)圖像顯示相同區(qū)域的相差圖像。比例尺=100µm
本研究旨在探索使用一種簡單但有效的標(biāo)記方法進行共培養(yǎng)和遷移研究。使用Cellaris™細胞標(biāo)記試劑盒成功標(biāo)記了MCF-7和NIH-3T3細胞，隨后將其用于與Culture-Insert 2 Well劃痕插件進行的細胞侵襲劃痕實驗。Cellaris™細胞標(biāo)記試劑盒和Culture-Insert 2 Well劃痕插件的易用性，使得實驗操作簡便，并能獲得可靠且可重現(xiàn)的結(jié)果。
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